化学-酶法制备稳定性同位素标记的¹⁵N-L-酪氨酸的研究 
摘  要

 
本文通过化学－酶法途径制备了稳定性同位素标记的¹⁵N-L-酪氨酸，以大肠杆菌菌体所含的天冬氨酸转氨酶催化由对羟基苯丙酮酸和¹⁵N-L-天冬氨酸等组成的底物溶液转化成含¹⁵N-L-酪氨酸的反应液，并对相关的工艺进行了优化研究，取得了较好的效果，最终研究了分离纯化的工艺，对反应液分离纯化后得到了¹⁵N-L-酪氨酸产品。主要研究内容和结果如下：
1.首先通过化学法合成了酶促反应的重要底物----对羟基苯丙酮酸：以对羟基苯甲醛和海因（即乙内酰脲）为原料，在乙醇胺的催化下通过两步反应合成了对羟基苯丙酮酸，总收率为30％左右。
2.应用正交实验法优化了利用大肠杆菌A.S.1.2463产生天冬氨酸转氨酶的培养基的最佳组成；通过研究不同培养条件对发酵产酶的影响，确定了发酵培养的最佳条件。同时对酶促反应过程中的反应温度、pH、Mn2⁺、酶浓度、辅酶磷酸吡哆醛(PLP)浓度、氨基供体L-天冬氨酸添加量等因素对转化率的影响进行了研究，确定了较佳的酶转化反应条件，转化率可达80％以上。
3.研究获得了全新的分离纯化L-酪氨酸的工艺，具体流程为：将转化液用盐酸调节pH至2，过滤除去菌体，再用乙酸乙酯萃取与反萃取去除了多余的反应底物对羟基苯丙酮酸，所得水相经赶酯浓缩后再上732氢型树脂柱，经NH₄Cl梯度洗脱后再上柱除盐，最后得到产品L-酪氨酸及回收的L-天冬氨酸，整个分离纯化收率达85％以上。
4.在整个工艺路线打通的基础上，进行了含有稳定性同位素¹⁵N标记的丰度实验。针对¹⁵N丰度下降问题,在优化了发酵培养基后，还考察了氨基供体¹⁵N-L-天冬氨酸、辅酶磷酸吡哆醛(PLP)等对产品丰度的影响，最终高丰度实验产品的丰度达98.62％，比原料下降了0.44％，¹⁵N利用率达40.78％，得到了较为理想的实验结果。
 
关键词：¹⁵N-L-酪氨酸；天冬氨酸转氨酶；对羟基苯丙酮酸；制备